Yapım süresi yaklaşık 16 yıl süren yapı 1427 ile 1443 yılları arasında, Sultan II. Murat tarafından, Mimar Musluhiddin ve Mehmet adındaki kalfasına yaptırılmıştır. Sultan II. Murat köprünün yapımına nezaret etmesi için Üsküp Sancak Beyi İshak Bey ve Gazi Mahmut Beyi görevlendirmiştir. Dünyada günümüze ulaşmayı başarabilen en eski ve en uzun taş köprü unvanına sahiptir. 2015 yılında, UNESCO tarafından dünya geçici kültür miras listesine alınmıştır. Yapıldığı dönem dikkate alındığında inşaat sürecinin çok zorlu olduğu tahmin edilebilir. Köprünün yapıldığı dönemde çimento olmadığı için harç malzemesi olarak sönmüş kireçle tuğla kırıntılarının karıştırılması ile elde edilen ve Horasan harcı denilen bir malzeme kullanılmıştır. Elde edilen bu harç kesme taşları birbirine yapıştırmak için kullanılmış, harcın açık havada sertleşerek yapıyı güçlü kılması için, köprünün açılışı, yapımı bittikten iki yıl sonra gerçekleştirilmiştir. Köprünün inşaatında traverten cinsi kesme taş blokları ve kireçtaşı kullanılmıştır.

Köprünün yapımı öncelikli olarak stratejik ve ekonomik amaçlarla gerçekleştirilmiştir. Kuruluş döneminde olan Osmanlı Devleti’nin Balkanlara açılmasını sağlayacak bir yol teşkil edeceği için Sultan II. Murat tarafından köprünün yapımına büyük önem verdiği düşünülmektedir. Köprünün yapımıyla birlikte, Ergene Nehri’nde kış ve ilkbahar aylarında meydana gelen su taşkınları bertaraf edilecek, bu sayede Osmanlı ordusunun Rumeli yönüne ilerlemesinin önünde bir engel kalmayacaktı. Uzunköprü, yapıldığı dönemde verilen isim olan Cisr-i Ergene (Ergene Köprüsü) olarak da bilinmektedir. Köprü, Osmanlı Devleti'nin sanat ve estetik anlayışını yansıtan motiflere sahiptir. Kemerlerin üzerinde bitki ve hayvan figürleri, bulunmaktadır. 174 adet kemer üzerine kurulmuş olan köprü döneminin en görkemli yapıları arasında gösterilmektedir. Kemerlerin önemli bir bölümü çift merkezli sivri kemer şeklindedir. Bunun dışında basık dairesel şeklinde kemerler de bulunmaktadır. En geniş kemeri 13 metre, ikinci su yatağının geçtiği kemer dokuz metre, kalan kemerlerin genişliği ise ortalama beş metre genişliktedir. Köprünün uzunluğu yaklaşık 1.270 metredir. Köprünün inşa edilmeye başlanmasıyla birlikte II. Murat adına bir camii, hamam, imarettin medresesi ve Yayalar Köyü’nün inşaat süreci de başlamıştır. Bu inşaatlar da bugünkü Uzunköprü ilçesinin temellerini oluşturmuştur.